细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时,会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时,较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时,细胞之外观较无明显变化,但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表,如下:
国家 受支原体污染(%) 报告年度
USA-FDA 15 1993(past 30 years)
USA-ATCC 15-20 1992
Japan-(IFO,RIKEN,JCR 80~30~22 1981 1987-19931998
Germany-DSM 36 1990-1994
Argentina 65 1987
Israel 32 1986-1993
China 95 1990
造成支原体高污染率的原因为:
1、支原体size 0.1~0.8 um,无细胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.45 um)
2、支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4、细胞流通间缺乏品管,造成实验室间的相互污染
5、研究或操作人员忽略污染问题
支原体污染了来源:
1、已受污染的细胞
2、操作人员的疏失
3、已受污染的培养基、血清
4、操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛,实验室之操作人员的污染亦可能为污染源,须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时,最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃,以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染,有以下几种方法,只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染:
1、抗生素处理:BM-cyclin(Roche),MRA(mycoplasma removal agent,ICN),Ciprofloxcin(Bayer),Enrofloxacin(Bayer)
2、Nucleic acid metabolites:5-bromouracil,Hoechst 33258,bromodeoxyuridine
3、Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意:
设备方面:
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面:定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
有关支原体污染之问题与回答:
1、应如何避免细胞污染?
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
2、如果细胞发生微生物污染时, 应如何处理?
直接灭菌后丢弃之。
3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?
不能。 除极有经验之专家外, 大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。
4、支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为 mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
5、侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?
直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。
支原体之检测:
直接培养法
原理:直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成。
特点:是目前最直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
缺点:培养时间长,须3-5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组,可能会造成污染。
材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次打开厌氧缸后,用70% ethanol擦拭内壁。)
培养基制备:
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长,可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1:2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) :称取50 g dextrose,10 g L-arginine HCl,溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中,保存于 -70℃。
· 液体培养基 (1 liter) :称取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中,加热搅拌溶解之。灭菌121℃,15分钟。待温度降低至室温后,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15% yeast extract solution,及100ml解涷之10x stock solution,混合均匀后,分装至已灭菌之有盖螺旋试管中,10ml/管。保存于4℃,期限1个月。
· 固体培养基 (1 liter ):称取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red,15g Bacto agar于600ml蒸馏水中,加热溶解之。灭菌121℃,15分钟。放在50℃水中浴中,待温度降低至50℃时,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution,混合均匀后,倒入60x50㎜之无菌培养皿中,5ml/培养皿。保存于4℃,期限1个月。
步骤:
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,接种于液体培养基中,置于37℃培养二周,观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后,分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上,将其倒放置于37℃厌氧箱培养,培养至少3星期,持续观察是否有支原体之菌落出现。
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,涂抹在agar plate上,37℃厌氧培养3星期,持续观察是否支原体菌落出现。
· 另作正负反应对照组,正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
结果判读:
· 支原体生长较慢,所以先在液体培养基培养1~2周增殖后,再培养于agar plate上。需至少培养3星期后,才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like),乃是由于支原体往agar下层生长所致,为圆形无色透明菌落,大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落,有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态(slime)。
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自agar plate上切下,重新培养于液体培养基中,培养一星期后再种入agar plate,若是细胞则不会生长。